Leprosy

1- Viable M. leprae as a research reagent

Richard W. Truman; James L. Krahenbuhl

Mycobacterium leprae remain a rare research resource. They cannot be cultivated on artificial media, and the only established means to quantify viability of M. leprae has been by its relative growth in the foot pads of conventional mice (MFP). The MFP method is technically difficult and requires several months to yield results. More effective methods are needed. We examined the association between M. leprae's ability to oxidize ¹⁴C-palmitate in axenic culture and the MFP growth results of a large number of suspensions. Oxidative activity was assessed by radiorespirometry (RR) using the Buddemeyer-type biphasic culture vessels containing 7H12 liquid medium and ¹⁴C-palmitate, or with commercially prepared BACTEC 12B vessels containing the same medium. The RR results were highly correlated (r = 0.71) with the growth level that each M. leprae suspension achieved by the MFP technique. In using this technique to examine the effects that many common laboratory practices have on M. leprae viability, we found that viability varies markedly between bacillary suspensions derived from different hosts and tissues. The highest viabilities were obtained with bacilli from moderately enlarged nude MFP(<1 g). Viability tended to be lower among very large nude MFP or long-duration infections and from armadillo tissues. After their harvest from host tissues, leprosy bacilli lost viability quickly. Suspensions stored in 7HI2 liquid medium retained <1% of their viability within 3 weeks of harvest, and freezing bacillary preparations or incubating them at 37°C resulted in nearly an immediate equivalent loss in metabolic activity and viability. M. leprae viability is maintained best when bacilli are stored for only short periods of time at 4°C-33°C. Palmitate oxidation is a rapid, reliable and objective means by which to estimate the viability of M. leprae and can be used effectively as a surrogate for the conventional MFP technique in many studies.

Mycobacterium leprae demeurent une ressource rare pour la recherche. Ils ne peuvent cire cultivés sur milieu artificiel, et la seule méthode pour quantilier la viabilité se M. leprae a été de mesurer sa croissance relative dans la plante de patte de souris conventionnelles (PPS). La méthode PPS est techniquement difficile et demande plusieurs mois avant de pouvoir obtenir in résultat. Des méthodes plus efficaces seraient les bienvenues. Nous avons examiné l'association entre la capacité de A7. leprae à oxyder le l4C-palmitate dans des cultures axéniques et les résultats d'un taux de croissance des PPS d'un grand nombre de suspensiones. L'activité oxydante lui évaluée par radio-respirométrie (RR) en utilisant le flaçon de culture biphasique de Buddemeyer contenant le milieu liquide de culture 7H12 et du ¹⁴C-palmitate ou des (laçons BACTEC 12B préparés commercialement contenant le même milieu de culture. Les résultats de RR furent hautement corrélés (r = 0,71 ) avec les niveaux de croissance que chaque suspension de M. leprae a atteinte par la technique des PPS. Nous avons utilisé cette technique pour examiner l'impact sur la viabilité de M. leprae de quelques pratiques de laboratoire et nous avons constaté que la viabilité varie beaucoup entre des suspensions de bacilles provenant de tissus et d'hôtes différents. Les viabilités les plus élevées furent obtenues de suspensions bacillaires provenant de PPS de souries nues de taille moyenne (inférieure à 1 gramme). La viabilité tendait à être moindre parmi les PPS de grande à très grande taille ou celles avec une infection de longue durée et parmi les tissus infectés de tatous à neuf bandes. Après leur isolement à partir des tissus lésés de l'hôte, les bacilles lépreux pendent rapidement leur viabilité. Les suspensions stockées 3 semaines dans le milieu de culture liquide 7H12 après collection des lépromes ont fortement perdu en viabilité, ne gardent que moins de 1% de leur viabilité initiale. La congélation ou l'incubation à 37°C de préparations bacillaires a entraîné une parte équivalente d'activité métabolique et de viabilité. Le meilieur moyen de conserver une bonne viabilité de M. leprae est de les conserver pendent une courte période entre 4 et 33°C. L'oxydation du palmitate est un moyen rapide, objectif et sûr d'estimer la viabilité de M. leprae et peut être utilisé comme méthode complémentaire à la technique PPS conventionnelle pour l'estimation de la viabilité dans de nombreuses études.

Mycobacterium leprae sigue siendo un raro espécimen de investigation. No se ha podido cultivar en médios de cultivo artificiales y cl único medio establecido para cuantificar la viabilidad de M. leprae es su crecimiento relativo en la almohadilla plantar dei ratón (APR). El método de la APR es técnicamente dilicil y requiere vários meses para obtener resultados. Se necesitan métodos más efectivos. En este trabajo, examinamos la asociación entre la habilidad de M. leprae para oxidar el ¹⁴C-palmitato en un cultivo axénico y su capacidad de crecimiento en la APR. La oxidación del palmitato se estableeió por radiorespirometría (RR) usando un sistema bifásico tipo Buddemeyer con medio 7H12 y ¹⁴C-palmitato, o con el sistema comercial BACTEC con el mismo medio. Los resultados de la RR mostraron una alta correlación (r = 0.71) con el nivel de crecimiento de M. leprae en la APR. Usando esta técnica para examinar los electos que tienen rnuchas prácticas de laboratorio sobre la viabilidad de M. leprae, encontramos que la viabilidad varia ampliamente entre las suspensiones de bacilos derivadas de diferentes huéspedes y tejidos. Las viabilidades más altas se obtuvieron con bacilos de las APR moderadamente engrosadas de ratones desnudos (<1 g). La viabilidad tendió a ser menor entre los bacilos de las APR nuiy engrosadas o en aquellas con mucho tiempo de infección y en las lesiones del tejido de armadillos. Después de su aislamiento de los tejidos infectados, el bacilo de la lepra perdió rápidamente su viabilidad. Las suspensiones mantenidas en el medio líquido 7H12 retuvieron menos del 1% de su viabilidad a las 3 semanas de su aislamiento y el congelamiento de las suspensiones, o su incubación a 37°C, condujeron a la perdida casi inmediata de su actividad metabólica y de su viabilidad. La viabilidad de M. leprae se preserva mejor cuando los bacilos se mantienen entre 4°C y 33°C por períodos coi tos de tiempo. La oxidación dei palmitato es una técnica rápida, corliable y objetiva para determinar Ia viabilidad de M. leprae y puede usarse como una alternativa de Ia técnica de la APR en muchos estúdios.

2- Limited ATP generation in cells of Mycobacterium leprae Thai-53 strain in enriched kirchner liquid medium containing adenosine

Masahiro Nakamura; Masanori Matsuoka

The ATP generation in cells of Mycobacterium leprae Thai-53 strain takes place in vitro when the cells are cultivated in Kirchner liquid medium, pH 7.0, enriched with egg-yolk solution, pyruvate, transferrin, and adenosine at 30°C. Among the supplements. adenosine was key and critical for the ATP generation. The optimal concentration of adenosine was 50 µg/ml of the medium. ATP generation, however, was limited; the rates of increase in ATP content extracted f rom the cells were approximately two- to threefold compared to that of the starting samples, and the increase reached a maximum at 4 or 6 weeks after incubation. No significant ATP generation in M. leprae cells was demonstrated in medium at pH 6.2 or pH 6.6, in the original Kirchner medium with or without adenosine, or when cultured at 37°C, or when containing an antileprosy drug. No detectable increase in the number of M. leprae cells was observed with the increase in intracellular ATP content and DNA replication. No effect was seen with renewal of the cultured medium by freshly prepared medium at 6 weeks' cultivation on the progressive ATP generation in M. leprae.

La production d'adénosine tri-phosphate (ATP) dans les cellules de Mycobacterium leprae de souche Thai-53 est obtenue in vitro lorsque les cellules sont cultivées dans le milieu de culture liquide de Kirchner à pH 7.0 complété par une solution de blanc d'oeuf, de pyruvate, de transferrine et d'adénosine incubé à 30°C. Parmi ces suppléments, l'adénosine était absolument nécessaire pour la production d'ATP. La concentration optimale d'adénosine était de 50 µg/ml dans le milieu de culture. La production d'ATP était cependant limitée en quantité et dans le temps : le taux d'augmentation de la molécule étant d'environ deux à trois fois par rapport à la quantité des énchantillons de départ, ²cette augmentation atteignant un maximum 4 à 6 semaines après la mise en incubation. Il n'y a pas eu de production significative d'ATP au sein des cellules M. leprae lorsqu'elles ont été incubées dans un milieu de culture à un pH de 6.2 ou 6,6: dans un milieu de Kirschner non modifié avec ou sans adénosine; ou lorsque incubé à 37°C; eu encore lorsque le milieu de culture contenait une molécule chimio-thérapeutique active contre la lèpre. Il n'y a pas eu d'augmentation détectable du nombre des cellules M. leprae accompagnant l'augmentation de la concentration intracellulaire en ATP et la réplication de l'ADN. Le renouvellement de l'ancien milieu de culture par un milieu de culture fraîchement préparé après 6 semaines de culture n'a pas eu d'effet positif sui la production d'ATP.

La generat ion de ATP en las células de Mycobacterium leprae , cepa Thai-53. ocurre in vitro cuando las células se cultivan a 30°C en el medio líquido de Kirchner. pH 7.0. enriquecido con una solución de yema de huevo, piruvato, transfcrrina y adenosina. Entre los suplementos, la adenosina lue crítica para la generación de ATP. La concentraeión óptima de adenosina lue 50 (µg/ml de medio. Sin embargo, la generación de ATP lue limitada: la tasa de incremento en cl contenido de ATP exiraido de las células lue apenas del doble o del triple de la encontrada en las muestras iniciales. y el incremento alcanzó su máximo nivel entre las 4 y 6 semanas de incubación. No se observo una producción significativa de ATP en las células de M. leprae cuando éstas se cultivaron (a) en el medio a pH 6.2 ó 6.6. (b) en el medio original de Kirchner, con o sin adenosina, (c) a 37°C. o (d) en el medio conteniendo alguna droga antileprosa. Tampoco se observo ningún incremento en el número de células de M. leprae relacionado con el incremento intracelular de ATP o con la replicación dei DNA. El cambio del medio de cultivo a las 6 semanas por medio fresco, no tuvo ningún electo sobre la generación progresiva de ATP en el cultivo in vitro de M. leprae.

3- PCR-restriction fragment length polymorphism analysis (PRA) of Mycobacterium leprae f rom human lepromas and f rom a natural case of an armadillo of corrientes, Argentina

Martin Jose Zumarraga; Edmundo Hector Resoagli; Maria Elena Cicuta; Anibal Ramon Martinez; Maria Isabel Ortiz de Rott; Sonnia Gracia de Millan; Karina Caimi; Andrea Gioffre; Alicia Alito; Fabiana Bigi; Angel Adrian Cataldi; Maria Isabel Romano

Polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism analysis (PRA) which relies on the amplification of a 439-bp portion of the hsp65 gene present in all mycobacteria, followed by two distinct digestions (with BstEII and HaeIII) of the PCR product, offers a rapid and easy alternative that allows identification of the species without the need for specialized equipment. Wild leprosy in the nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus) is characterized by the presence of multiple bacilli in internal organs such as lymph nodes, spleen and liver, as well as in nerves and skin. We could observe this in 9 out of 132 animals captured in Corrientes, Argentina, an area endemic for leprosy in humans. Mycobacterium leprae were recognized in those naturally infected animals through different techniques. Three samples of extracted DNA of the mycobacteria present in the spleen, liver and popliteal lymph node of a naturally infected animal during the Experimental Program in Armadillo (PEA) and three samples of human lepromas were processed by PRA. The patterns of the six samples analyzed were identical and were characteristic of M. leprae. These studies, made for the first time in Argentina, corroborate the initial discoveries in South America made by our investigative group on the detection of armadillos naturally infected with the Hansen bacillus.

La réaction de Polymerase en chaîne (PCR) associée à l'analyse du polymorphisme des fragments obtenus après digestion par des enzymes de restriction (PRA), qui s'applique ici à l'amplification du segment de 439 paires de base du gène hsp65 qui est présent chez toutes les myeobaetéries, siuvi de deux digestions distinctes par BstEII et Baelll des produits du PCR. représente une méthode facile et rapide qui permet l'identification des espèces sans la nécessité d'un équipement spécialisé. La lèpre chez le tatou à neuf bandes (Dasypus novemcinctus) est caractérisée par la présence de très nombreux bacilles dans les organes internes comme les nœuds lymphatiques, la rate et le foie, ainsi que les nerfs et la peau. Nous avons pu observer cela dans neuf parmi 32 animaux qui furent capturés à Corrientes en Argentine, une région endémique de lèpre humaine. Mycobacterium leprae fut identifiée par diférentes techniques. Trois échantillons d'ADN isolés de myeobaetéries présentes dans la rate, le foie et le nœud lymphatique poplité d'un animal naturellement infecté durant le programme expérimental chez le tatou (PHA) et trois échantillons de lépromes humains préparés pour une PRA. La distribution des bandes de restriction était identique et caractéristique de M. leprae dans les 6 échantillons testés. Ces études, menées pour la première fois en Argentine, corroborent la découverte initiale faite par notre groupe de la présence de tatous naturellement inféetés par le bacille de Hansen.

HI análisis por PCR del polimorfismo en el largo de los fragmentos restriclivos (PRA) dei ADN, que se basa en la amplification de una porción de 439 pb del gen hsp65 presente en Iodas las micobacterias. seguido de dos digestiones diferentes dei produeto de PCR. ofrece una alternativa rápida y fácil que permite la identification de la especie, sin la necesidad dc dificultosas pruebas bioquímicas. La lepra salvaje en el armadillo de nueve bandas (Dasypus noveincinctus. Linné, 1758) cursa con la presencia de abundantes bacilos con localization preferentemente linfo-espleno-hepática, con compromiso nervioso y dérmico. tal cual se pudo observar en animales capturados en la província dc Corrientes, Argentina. zona endémica de la enfermedad en humanos. Habiéndose reconocido Mycobacterium leprae, infectando naturalmente estos armadillos, a través de diferentes técnicas, se procesaron, por medio de la técnica de PRA. très muestras de ADN extraído de las micobacterias presentes en bazo, hígado y linfoglándula patelar de un animal naturalmente infectado obtenido dentro del PEA, y de très muestras de lepromas humanos de pacientes de la misma província. Los seis patrones logrados coinciden con los de esta especie, caracterizándose por la obtención uniforme de fragmentos característicos de M. leprae, Estos estúdios. efectuados por primera vez en Argentina, corroboran los hallazgos initiales en Sudamérica hecho por este grupo de investigation, sobre la detection de armadillos naturalmente infectados con el bacilo de Hansen.

4- Factors influencing the development of leprosy: an overview

Ben Naafs; Eliane Silva; Fatima Vilani-Moreno; Elaine Camarinha Marcos; Maria Esther Nogueira; Diltor V. A. Opromolla

Abstract
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The clinical manifestations of leprosy vary, seemingly depending on the host's immune response. Mode and route of infection, such as skin versus nasal mucosa, insect bites, sexual and gastroenteral transmission, together with genetic factors that may contribute to the outcome of the infection. including HLA, Lewis factor, NrampI and more subtle inherited alterations, are discussed. It is theorized that a balance between host responses elicited by different routes of infection and size and spacing of inocula is responsible for the clinical and immunological manifestations of the disease. Genetic factors and contact with environmental microorganisms may modulate these responses. The final result, resistance, delayed-type hypersensitivity, tolerance, disease or no disease, spectrum and reactions, is most likely reached via the orchestration of the induced cyto- and chemokines.